Co to jest CRISPR?

Technologia CRISPR to proste, ale potężne narzędzie do edycji genomów. Umożliwia naukowcom łatwą zmianę sekwencji DNA i modyfikację funkcji genów. Jego wiele potencjalnych zastosowań obejmuje korygowanie defektów genetycznych, leczenie i zapobieganie rozprzestrzenianiu się chorób oraz ulepszanie upraw. Jednak jego obietnica budzi również obawy etyczne.

W popularnym użyciu „CRISPR” (wymawiane „ostrzejszy”) jest skrótem od „CRISPR-Cas9”. CRISPR to wyspecjalizowane odcinki DNA. Białko Cas9 (lub „związane z CRISPR”) jest enzymem, który działa jak para molekularnych nożyczek, zdolnych do cięcia nici DNA.

Technologia CRISPR została zaadaptowana na podstawie naturalnych mechanizmów obronnych bakterii i archeonów (domena mikroorganizmów jednokomórkowych). Organizmy te wykorzystują RNA pochodzące z CRISPR i różne białka Cas, w tym Cas9, do udaremniania ataków wirusów i innych ciał obcych. Robią to głównie poprzez siekanie i niszczenie DNA obcego najeźdźcy. Kiedy te składniki są przenoszone do innych, bardziej złożonych organizmów, pozwala to na manipulację genami, czyli „edycję”.

Do 2017 roku nikt tak naprawdę nie wiedział, jak wygląda ten proces. W artykule opublikowanym 10 listopada 2017 r. W czasopiśmie Nature Communications, zespół naukowców pod kierownictwem Mikihiro Shibaty z Uniwersytetu Kanazawa i Hiroshi Nishimasu z Uniwersytetu Tokijskiego pokazał, jak to wygląda, gdy CRISPR jest w akcji po raz pierwszy. czas. [Zapierający dech w piersiach nowy GIF pokazuje, że CRISPR przeżuwa DNA]

CRISPR-Cas9: Kluczowi gracze

CRISPRs: "CRISPR „oznacza„ skupiska regularnie przeplatanych krótkich powtórzeń palindromicznych ”. Jest to wyspecjalizowany region DNA o dwóch odrębnych cechach: obecność powtórzeń nukleotydów i przerywników. Powtarzane sekwencje nukleotydów - cegiełki DNA - są rozmieszczone w całym CRISPR Odstępniki to fragmenty DNA przeplatane tymi powtórzonymi sekwencjami.

W przypadku bakterii odstępniki są pobierane z wirusów, które wcześniej zaatakowały organizm. Służą jako bank pamięci, który umożliwia bakteriom rozpoznawanie wirusów i odpieranie przyszłych ataków.

Zostało to po raz pierwszy zademonstrowane eksperymentalnie przez Rodolphe'a Barrangou i zespół naukowców z Danisco, firmy zajmującej się składnikami żywności. W artykule z 2007 roku opublikowanym w czasopiśmie Science naukowcy wykorzystali Streptococcus thermophilus bakterie, które powszechnie występują w jogurcie i innych kulturach mlecznych, jako ich model. Zaobserwowali, że po ataku wirusa do regionu CRISPR włączono nowe przerywniki. Ponadto sekwencja DNA tych przerywników była identyczna z częściami genomu wirusa. Zmanipulowali także odstępniki, usuwając je lub wprowadzając nowe sekwencje wirusowego DNA. W ten sposób byli w stanie zmienić odporność bakterii na atak konkretnego wirusa. W ten sposób naukowcy potwierdzili, że CRISPR odgrywają rolę w regulacji odporności bakterii.

CRISPR RNA (crRNA): Po włączeniu odstępnika i ponownym ataku wirusa, część CRISPR jest transkrybowana i przetwarzana na CRISPR RNA lub „crRNA”. Sekwencja nukleotydowa CRISPR działa jako matryca do wytwarzania komplementarnej sekwencji jednoniciowego RNA. Każdy crRNA składa się z powtórzenia nukleotydu i części dystansowej, zgodnie z przeglądem Jennifer Doudna i Emmanuelle Charpentier z 2014 roku, opublikowanym w czasopiśmie Science.

Cas9: Białko Cas9 to enzym, który tnie obce DNA.

Białko zazwyczaj wiąże się z dwiema cząsteczkami RNA: crRNA i inną nazywaną tracrRNA (lub „trans-aktywujący crRNA”). Obaj następnie kierują Cas9 do miejsca docelowego, gdzie dokona cięcia. Ta przestrzeń DNA jest komplementarna do 20-nukleotydowego odcinka crRNA.

Używając dwóch oddzielnych regionów lub „domen” w swojej strukturze, Cas9 przecina obie nici podwójnej helisy DNA, tworząc tzw. „Dwuniciowe pęknięcie”, zgodnie z artykułem Science z 2014 roku.

Jest wbudowany mechanizm bezpieczeństwa, który zapewnia, że ​​Cas9 nie tnie po prostu w dowolnym miejscu genomu. Krótkie sekwencje DNA znane jako PAM („sąsiadujące motywy protoprzerywnika”) służą jako znaczniki i znajdują się obok docelowej sekwencji DNA. Jeśli kompleks Cas9 nie widzi PAM obok swojej docelowej sekwencji DNA, nie zostanie przecięty. Jest to jeden z możliwych powodów, dla których Cas9 nigdy nie atakuje regionu CRISPR u bakterii, według przeglądu z 2014 roku opublikowanego w Nature Biotechnology.

CRISPR-Cas9 jako narzędzie do edycji genomu

Genomy różnych organizmów kodują szereg komunikatów i instrukcji w obrębie ich sekwencji DNA. Edycja genomu obejmuje zmianę tych sekwencji, a tym samym zmianę wiadomości. Można tego dokonać, wprowadzając nacięcie lub przerwę w DNA i oszukując naturalne mechanizmy naprawy DNA komórki, aby wprowadzić pożądane zmiany. CRISPR-Cas9 zapewnia do tego środki.

W 2012 roku w czasopismach Science i PNAS opublikowano dwie kluczowe prace badawcze, które pomogły przekształcić bakteryjny CRISPR-Cas9 w proste, programowalne narzędzie do edycji genomu.

Badania przeprowadzone przez oddzielne grupy wykazały, że Cas9 może być skierowany na przecięcie dowolnego regionu DNA. Można to zrobić po prostu zmieniając sekwencję nukleotydową crRNA, która wiąże się z komplementarnym celem DNA. W artykule Science z 2012 roku Martin Jinek i współpracownicy dodatkowo uprościli system, łącząc crRNA i tracrRNA w celu stworzenia jednego „przewodniego RNA”. Zatem edycja genomu wymaga tylko dwóch składników: przewodnika RNA i białka Cas9.

„Pod względem operacyjnym projektujesz odcinek 20 par zasad [nukleotydów] pasujących do genu, który chcesz edytować” - powiedział George Church, profesor genetyki z Harvard Medical School. Skonstruowana jest cząsteczka RNA komplementarna do tych 20 par zasad. Church podkreślił znaczenie upewnienia się, że sekwencja nukleotydów znajduje się tylko w genie docelowym i nigdzie indziej w genomie. „Wtedy RNA plus białko [Cas9] przecinają - jak nożyczki - DNA w tym miejscu, a najlepiej nigdzie indziej” - wyjaśnił.

Po przecięciu DNA uruchamiają się naturalne mechanizmy naprawcze komórki i pracują nad wprowadzeniem mutacji lub innych zmian do genomu. Może się to zdarzyć na dwa sposoby. Zgodnie z projektem Huntington's Outreach Project na Uniwersytecie Stanforda, jedna metoda naprawy polega na sklejeniu dwóch nacięć z powrotem. Ta metoda, znana jako „niehomologiczne łączenie końców”, zwykle wprowadza błędy. Nukleotydy są przypadkowo wstawiane lub usuwane, co powoduje mutacje, które mogą zakłócić gen. W drugiej metodzie przerwanie jest naprawiane przez wypełnienie luki sekwencją nukleotydów. Aby to zrobić, komórka używa krótkiej nici DNA jako szablonu. Naukowcy mogą dostarczyć wybrany przez siebie szablon DNA, wpisując w ten sposób dowolny gen lub korygując mutację.

Użyteczność i ograniczenia

CRISPR-Cas9 stał się popularny w ostatnich latach. Church zauważa, że ​​technologia jest łatwa w użyciu i około cztery razy bardziej wydajna niż poprzednie najlepsze narzędzie do edycji genomu (zwane TALENS).

W 2013 roku pierwsze doniesienia o używaniu CRISPR-Cas9 do edycji ludzkich komórek w warunkach eksperymentalnych zostały opublikowane przez naukowców z laboratoriów Church i Feng Zhang z Broad Institute of the Massachusetts Institute of Technology and Harvard. Badania z wykorzystaniem in vitro (laboratoryjnych) i zwierzęcych modeli chorób człowieka wykazały, że technologia może skutecznie korygować defekty genetyczne. Przykłady takich chorób obejmują mukowiscydozę, zaćmę i anemię Fanconiego, zgodnie z artykułem przeglądowym z 2016 roku opublikowanym w czasopiśmie Nature Biotechnology. Badania te torują drogę do zastosowań terapeutycznych u ludzi.

„Myślę, że opinia publiczna CRISPR jest bardzo skoncentrowana na pomyśle klinicznego wykorzystania edycji genów do leczenia chorób” - powiedział Neville Sanjana z New York Genome Center i adiunkt w dziedzinie biologii, neuronauki i fizjologii na New York University. „Bez wątpienia jest to ekscytująca możliwość, ale to tylko jeden mały element”.

Technologia CRISPR została również zastosowana w przemyśle spożywczym i rolniczym do projektowania kultur probiotycznych i szczepień kultur przemysłowych (na przykład jogurtów) przeciwko wirusom. Jest również stosowany w uprawach w celu poprawy plonów, tolerancji na suszę i właściwości odżywczych.

Innym potencjalnym zastosowaniem jest tworzenie napędów genowych. Są to systemy genetyczne, które zwiększają prawdopodobieństwo przekazania określonej cechy z rodzica na potomstwo. Według Instytutu Wyss ostatecznie z biegiem pokoleń ta cecha rozprzestrzenia się na całe populacje. Napędy genowe mogą pomóc w kontrolowaniu rozprzestrzeniania się chorób, takich jak malaria, poprzez zwiększanie bezpłodności wśród nosicieli choroby - kobiet Anopheles gambiae komary - zgodnie z artykułem Nature Biotechnology 2016. Ponadto, napędy genowe mogą być również wykorzystywane do eliminowania gatunków inwazyjnych i odwracania odporności na pestycydy i herbicydy, zgodnie z artykułem Kennetha Oye i współpracowników z 2014 roku, opublikowanym w czasopiśmie Science..

Jednak CRISPR-Cas9 nie jest pozbawiony wad.

„Myślę, że największym ograniczeniem CRISPR jest to, że nie jest w stu procentach skuteczny” - powiedział Church. Co więcej, wydajność edycji genomu może się różnić. Zgodnie z artykułem Science 2014 autorstwa Doudny i Charpentiera, w badaniu przeprowadzonym na ryżu, edycja genów wystąpiła w prawie 50 procentach komórek, które otrzymały kompleks Cas9-RNA. Podczas gdy inne analizy wykazały, że w zależności od celu, wydajność edycji może sięgać nawet 80 procent lub więcej.

Istnieje również zjawisko „efektów niecelowych”, polegające na cięciu DNA w miejscach innych niż zamierzony cel. Może to prowadzić do wprowadzenia niezamierzonych mutacji. Co więcej, Church zauważył, że nawet gdy system wycina cel, istnieje szansa, że ​​nie uzyska dokładnej edycji. Nazwał to „wandalizmem genomu”.

Ustalanie limitów

Wiele potencjalnych zastosowań technologii CRISPR rodzi pytania dotyczące etycznych zalet i konsekwencji ingerencji w genomy.

W artykule Science z 2014 roku Oye i współpracownicy wskazują na potencjalny wpływ wykorzystania napędów genów na środowisko. Wprowadzona cecha może rozprzestrzenić się poza populację docelową na inne organizmy poprzez krzyżowanie. Napędy genowe mogą również zmniejszyć różnorodność genetyczną populacji docelowej.

Wprowadzanie modyfikacji genetycznych do ludzkich embrionów i komórek rozrodczych, takich jak plemniki i komórki jajowe, jest znane jako edycja linii zarodkowej. Ponieważ zmiany w tych komórkach mogą być przekazywane kolejnym pokoleniom, użycie technologii CRISPR do edycji linii zarodkowych wzbudziło szereg wątpliwości etycznych.

Zmienna skuteczność, efekty niecelowe i nieprecyzyjne edycje stanowią zagrożenie dla bezpieczeństwa. Ponadto wiele jest wciąż nieznanych społeczności naukowej. W artykule z 2015 roku opublikowanym w Science, David Baltimore i grupa naukowców, etyków i ekspertów prawnych zauważają, że edycja linii germinalnej stwarza możliwość niezamierzonych konsekwencji dla przyszłych pokoleń, „ponieważ istnieją ograniczenia naszej wiedzy na temat genetyki człowieka, interakcji między genami a środowiskiem, i ścieżki choroby (w tym wzajemne oddziaływanie między jedną chorobą a innymi stanami lub chorobami tego samego pacjenta). ”

Inne kwestie etyczne są bardziej zniuansowane. Czy powinniśmy wprowadzać zmiany, które mogą zasadniczo wpłynąć na przyszłe pokolenia bez ich zgody? A co, jeśli użycie edycji linii germinalnej zmieni się z narzędzia terapeutycznego w narzędzie do ulepszania różnych ludzkich cech?

Aby rozwiązać te obawy, Narodowe Akademie Nauk, Inżynierii i Medycyny przygotowały obszerny raport zawierający wytyczne i zalecenia dotyczące edycji genomu..

Chociaż National Academies wzywają do ostrożności przy redagowaniu linii germinalnych, podkreślają, że „ostrożność nie oznacza zakazu”. Zalecają, aby edycja linii germinalnych była przeprowadzana tylko na genach, które prowadzą do poważnych chorób i tylko wtedy, gdy nie ma innych rozsądnych alternatyw leczenia. Wśród innych kryteriów podkreślają potrzebę posiadania danych na temat zagrożeń i korzyści dla zdrowia oraz potrzebę ciągłego nadzoru podczas badań klinicznych. Zalecają również monitorowanie rodzin przez wiele pokoleń.

Najnowsze badania

Wokół CRISPR pojawiło się wiele ostatnich projektów badawczych. „Tempo odkryć w zakresie badań podstawowych gwałtownie wzrosło dzięki CRISPR” - powiedział biochemik i ekspert CRISPR Sam Sternberg, lider grupy ds. Rozwoju technologii w Caribou Biosciences Inc. z siedzibą w Berkeley w Kalifornii, która opracowuje rozwiązania dla medycyny oparte na CRISPR, rolnictwo i badania biologiczne.

Oto niektóre z najnowszych ustaleń:

• W kwietniu 2017 r. Zespół naukowców opublikował w czasopiśmie Science badanie, że zaprogramowali cząsteczkę CRISPR w celu wykrycia szczepów wirusów, takich jak Zika, w surowicy krwi, moczu i ślinie..
• 2 sierpnia 2017 r. Naukowcy ujawnili w czasopiśmie Nature, że z powodzeniem usunęli wadę serca u zarodka za pomocą CRISPR.
• 2 stycznia 2018 r. Naukowcy ogłosili, że mogą być w stanie powstrzymać grzyby i inne problemy zagrażające produkcji czekolady za pomocą CRISPR, aby uodpornić rośliny na choroby.
• Według badań opublikowanych przez czasopismo BioNews 16 kwietnia 2018 r. Naukowcy zaktualizowali CRISPR, aby edytować tysiące genów jednocześnie..

Dodatkowe raporty autorstwa Aliny Bradford, współautora.

Dodatkowe zasoby

• Broad Institute: Kalendarium kluczowych prac nad CRISPR
• Wiadomości z inżynierii genetycznej i biotechnologii: CRISPR-Cas9 ulepszony 10000-krotnie dzięki nukleotydom syntetycznym
• Broad Institute: Pytania i odpowiedzi dotyczące CRISPR